Genetic transformation of mouse cell line with equine genes of receptor infectious anemia virus (ELR1) and cyclin (eCT1)

 
PIIS250026270000651-1-1
DOI10.31857/S250026270000651-1
Publication type Article
Status Published
Authors
Affiliation: Federal`ny`j Nauchny`j Centr - Vserossijskij nauchno-issledovatel`skij institut e`ksperimental`noj veterinarii im. K.I. Skryabina i Ya.R. Kovalenko RAN
Address: Russian Federation, Moscow
Affiliation: Federal`ny`j Nauchny`j Centr - Vserossijskij nauchno-issledovatel`skij institut e`ksperimental`noj veterinarii im. K.I. Skryabina i Ya.R. Kovalenko RAN
Address: Russian Federation, Moscow
Affiliation: Federal`ny`j Nauchny`j Centr - Vserossijskij nauchno-issledovatel`skij institut e`ksperimental`noj veterinarii im. K.I. Skryabina i Ya.R. Kovalenko RAN
Address: Russian Federation, Moscow
Affiliation: Federal`ny`j Nauchny`j Centr - Vserossijskij nauchno-issledovatel`skij institut e`ksperimental`noj veterinarii im. K.I. Skryabina i Ya.R. Kovalenko RAN
Address: Russian Federation, Moscow
Journal nameRossiiskaia selskokhoziaistvennaia nauka
EditionNumber 5
Pages64-67
Abstract

The complexity of the pathogenesis and insufficient knowledge of the equine infectious anemia virus (EIAV) make it necessary to find an adequate laboratory model to study the infectious process and the immune response. One of the ways to solve this problem is to obtain cell cultures with the desired properties, through genetic transformation. The aim of the present work was to obtain mouse embryonic fibroblasts with genes of receptor of infectious anemia virus (ELR1) and cyclin T1 (eCT1) of the equine. For this, cells were transfected with calcium-phosphate method with plasmid pcDNA3.1-ELR1 and pcDNA3.1-cycT1 containing n of the target genes. Using the selection of cells on G418, 8 stable genetically transformed clones of STO cells with [ELR1eCT1neo]+phenotype were derived. The frequency of genetic transformation STO was 2,8x10-5. Integration of genes into the genome of cells was detected in PCR with primers geopoliticheskie with subsequent nucleotide sequencing, using as matrix the DNA isolated from cells. The expression of equine genes ELR1 and eCT1 in mouse fibroblasts was confirmed at the transcriptional level by the presence of the mRNA of the target genes in the reaction RT-PCR. The obtained stable cell line STO was deposited in the cell culture collection of Federal Research Center for Veterinary and can be used to study the mechanisms of action of ELR1 receptor, and equine cyclin T1, therefore, to get deeper insight of the equine infection anemia virus biology.

 

KeywordsEquine infectious anemia virus, equine cyclin T1, receptor ELR1,replication, murine STO cells, genetic transformation, transfection, susceptible to equine infectious anemia virus infection, cellular receptor, in vitro
Received21.08.2018
Publication date14.11.2018
Number of characters12577
Cite   Download pdf To download PDF you should sign in
Размещенный ниже текст является ознакомительной версией и может не соответствовать печатной
1 В связи с последними достижениями в молекулярной организации клеточных мембран, атомной структуре поверхностных вирусных белков, а также в их взаимодействии с молекулами рецепторов выявлены новые направления, касающиеся механизмов адсорбции и проникновения вирусов в клетку [1]. Все это способствует разработке новых технологий контроля над вирусными инфекциями посредством создания новых ингибиторов и вакцин. Рецепторы на клеточной мембране обеспечивают сайты связывания для вируса и также участвуют в структурной модуляции вирусных оболочек, что приводит к слиянию клеточных и вирусных мембран и вводу вириона на первой стадии вирусной инфекции. Соответственно изучение молекул клеточной мембраны в качестве рецепторов для вируса играет важную роль в разработке противовирусных реагентов и вакцин.
2 Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) – вирусная болезнь непарнокопытных (лошадь, мул, осел), которая характеризуется рецидивирующей лихорадкой, анемией, тромбоцитопенией и разнообразным течением: от острого до бессимптомного латентного. Возбудителем ИНАН лошадей является РНК-содержащий вирус (в англоязычной литературе - EIAV), который принадлежит семейству ретровирусов (Retroviridaе), подсемейству Orthoretrovirinae, роду лентивирусов (Lentiviridae) [2, 3]. Долгое время считалось, что тканевые макрофаги могут быть единственным клеточным типом у лошади, который поддерживает активную репликацию этого вируса. В литературе отсутствуют данные об инфекции вирусом ИНАН лимфоцитов или других типов клеток у инфицированных лошадей, что свидетельствует о высокой степени тропизма ИНАН в естественных условиях. Однако в культуре репликация вируса ИНАН наблюдается в других типах клеток лошади: дермальных фибробластах и клетках почки. Известно, что существуют культуры клеток других видов животных (собака, кошка), адаптированные к вирусу ИНАН, которые подробно описаны ранее [4].
3 В 2005 г. появилась работа, в которой авторам удалось выделить из макрофагов лошади и охарактеризовать единственный клеточный рецептор для этого вируса. Сначала для этого был найден и клонирован ген функционального рецептора для вируса ИНАН, названный лошадиный лентивирусный рецептор 1 (ELR1) [5]. Было показано, что этот рецептор присутствует на поверхности моноцитов и макрофагов лошадей in vitro и представляет собой белок, который принадлежит семейству рецепторов фактора некроза опухоли. Выделив и клонировав ген рецептора вируса ИНАН, был проведен ряд работ по генетической трансформации мышиных эмбриональных фибробластов линии NIH 3Т3 экзогенной ДНК, которая содержала нуклеотидные последовательности (н. п.) гена рецептора ELR1 под контролем сильного вирусного промотора ЦМВ (CMV) in vitro. Генетически трансформированные мышиные фибробласты с фенотипом [ELR1neo]+ были чувствительны к вирусу ИНАН в культуре. Оказалось, что наличие рецептора достаточно для втoржения вируса в мышиные фибробласты, однако для его репликации необходим ген циклин Т1 лошади (eCT1) [6, 7]. Продукт этого гена – клеточный белок, который ответственен за связывание с белком Tat лентивируса. Поэтому в следующей серии экспериментов по генетической трансформации мышиных фибробластов были получены клетки с фенотипом [ELR1eCT1neo]+. Такие клетки полностью поддерживали репликацию и продукцию вируса. Основываясь на результатах этой работы, были созданы трансгенные мыши с фенотипом [ELR1eCT1neo]+ [8]. Представляет большой интерес создание эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши, содержащих в геноме н.п. гена рецептора ELR1 вируса ИНАН и eCT1 лошади. Учитывая уникальные свойства ЭСК, которые мы подробно описали в своей работе [4], генетическая трансформация этих клеток позволит создать лабораторную модель для изучения патогенеза вируса ИНАН и иммунного ответа. Мышиные эмбриональные фибробласты линии STO широко используют в качестве фидерного слоя для культивирования многих линий ЭСК [4]. В связи с этим получение генетически трансформированных клеток STO было необходимо как для получения данных о роли рецептора вируса инфекционной анемии лошадей в проникновении вируса в клетку-мишень in vitro, так и для создания генетически-трансформированных ЭСК с фенотипом [ELR1 eCT1]+.

views: 1352

Readers community rating: votes 0

1. Dimitrov D. S. Cell Biology of Virus Entry // Cell. - 2000. - V.101. - P. 697-702.

2. Montelaro, R.C., Ball J.M., Rushlow K. Equine retroviruses // The Retroviridae. Edited by Levy J.A. - New York: Plenum Press. 1993. – P. 257-360. doi: 10.1007/978-1-4899-1627-3.

3. Leroux C., Cadore J.-L., Montelaro R.C. Equine infectious anemia virus (EIAV): what has HIV’s country cousin got to tell us? // Vet. Res. - 2004.- № 35. – P.485-512.

4. Savchenkova I.P., Alekseenkova S.V., Yurov K.P. Ehmbrional'nye stvolovye kletki myshi – perspektivnyj material dlya izucheniya virusa infektsionnoj anemii loshadej invitro i invivo // Voprosy virusologii. - 2016. - T. 61.- № 3. - S. 107-111.

5. Zhang B., Jin S., Jin J. Li F., Montelaro R.C. A tumor necrosis factor receptor family protein serves as a cellular receptor for the macrophage-tropic equine lentivirus // PNAS. - 2005. – V. 102. - № 28. – P. 9918-9923.

6. Zhang B., Sun C., Jin Ah., Cascio M., Montelaro R.C. Mapping of equine lentivirus receptor residues critical for equine infectious anemia virus envelope binding // J. of Virology. - 2008. – V. 82. - № 3.- P. 1204-1213.

7. Zhang B., Montelaro R.C. Replication of equine infectious anemia virus in engineered mouse NIH 3T3 cells // J Virol. - 2009.- V. 83.- № 4. – P. 2034-37.

8. Du C., Ma J., Liu Q., Li X.-J., Wang X-F., Meng Q-W., Wang X., Zhou J-H. Mice transgenic for equine cyclin T1 and ELR1 are susceptible to equine infectious anemia virus infection // Retrovirology. - 2015.- V. 12. P. 36. doi 10.1186/s12977-015-0163-7.

9. Qian L., Han X., Liu X. Structural insight into equine lentivirus receptor // Protein Science. - 2015. - V. 24. – P. 633-642.

(Таблица_1.jpg, 64 Kb) [Download]

(Таблица_.jpg, 44 Kb) [Download]

(Рисунок_1_.jpg, 17 Kb) [Download]

Система Orphus

Loading...
Up