Генетическая трансформация мышиной клеточной линии генами рецептора вируса инфекционной анемии (ELR1) и циклина T1 (eCT1) лошади

 
Код статьиS250026270000651-1-1
DOI10.31857/S250026270000651-1
Тип публикации Статья
Статус публикации Опубликовано
Авторы
Аффилиация: Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН
Адрес: Российская Федерация, Москва
Аффилиация: Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН
Адрес: Российская Федерация, Москва
Аффилиация: Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН
Адрес: Российская Федерация, Москва
Аффилиация: Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН
Адрес: Российская Федерация, Москва
Название журналаРоссийская сельскохозяйственная наука
ВыпускНомер 5
Страницы64-67
Аннотация

Сложность патогенеза и недостаточная изученность вируса инфекционной анемии лошадей (ИНАН) обусловливают необходимость изыскания адекватной лабораторной модели для изучения инфекционного процесса и иммунного ответа. Одним из способов решения данного вопроса является получение культур клеток с заданными свойствами посредством генетической трансформации. Целью настоящей работы было получение мышиных эмбриональных фибробластов с генами рецептора вируса инфекционной анемии (ELR1) и циклина T1 (eCT1) лошади. Для этого в клетки вводили кальций-фосфатным методом плазмиды pcDNA3.1-ELR1 и pcDNA3.1-cycT1, содержащие нуклеотидные последовательности целевых генов. Используя селекцию клеток на генетицине, было получено 8 стабильных генетически-трансформированных клонов клеток STO с фенотипом [ELR1eCT1neo]+. Частота генетической трансформации STO составляла 2,8х10-5. Встраивание генов в геном клеток выявляли в ПЦР с геноспецифическими праймерами с последующим нуклеотидным секвенированием, используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из клеток. Экспрессия генов ELR1 и eCT1 лошади в мышиных фибробластах была подтверждена на уровне транскрипции по наличию мРНК целевых генов в реакции ОТ-ПЦР. Полученная стабильная клеточная линия депонирована в коллекцию перевиваемых соматических культур сельскохозяйственных и промысловых животных Федерального научного центра – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии.

 

Ключевые словаВирус инфекционной анемии лошадей, ген рецептора вируса инфекционной анемии лошадей, ген циклина лошади, трансфекция, генетическая трансформация клетки, мышиные эмбриональные фибробласты in vitro
Получено21.08.2018
Дата публикации14.11.2018
Кол-во символов12577
Цитировать   Скачать pdf Для скачивания PDF необходимо авторизоваться
Размещенный ниже текст является ознакомительной версией и может не соответствовать печатной.
1 В связи с последними достижениями в молекулярной организации клеточных мембран, атомной структуре поверхностных вирусных белков, а также в их взаимодействии с молекулами рецепторов выявлены новые направления, касающиеся механизмов адсорбции и проникновения вирусов в клетку [1]. Все это способствует разработке новых технологий контроля над вирусными инфекциями посредством создания новых ингибиторов и вакцин. Рецепторы на клеточной мембране обеспечивают сайты связывания для вируса и также участвуют в структурной модуляции вирусных оболочек, что приводит к слиянию клеточных и вирусных мембран и вводу вириона на первой стадии вирусной инфекции. Соответственно изучение молекул клеточной мембраны в качестве рецепторов для вируса играет важную роль в разработке противовирусных реагентов и вакцин.
2 Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) – вирусная болезнь непарнокопытных (лошадь, мул, осел), которая характеризуется рецидивирующей лихорадкой, анемией, тромбоцитопенией и разнообразным течением: от острого до бессимптомного латентного. Возбудителем ИНАН лошадей является РНК-содержащий вирус (в англоязычной литературе - EIAV), который принадлежит семейству ретровирусов (Retroviridaе), подсемейству Orthoretrovirinae, роду лентивирусов (Lentiviridae) [2, 3]. Долгое время считалось, что тканевые макрофаги могут быть единственным клеточным типом у лошади, который поддерживает активную репликацию этого вируса. В литературе отсутствуют данные об инфекции вирусом ИНАН лимфоцитов или других типов клеток у инфицированных лошадей, что свидетельствует о высокой степени тропизма ИНАН в естественных условиях. Однако в культуре репликация вируса ИНАН наблюдается в других типах клеток лошади: дермальных фибробластах и клетках почки. Известно, что существуют культуры клеток других видов животных (собака, кошка), адаптированные к вирусу ИНАН, которые подробно описаны ранее [4].
3 В 2005 г. появилась работа, в которой авторам удалось выделить из макрофагов лошади и охарактеризовать единственный клеточный рецептор для этого вируса. Сначала для этого был найден и клонирован ген функционального рецептора для вируса ИНАН, названный лошадиный лентивирусный рецептор 1 (ELR1) [5]. Было показано, что этот рецептор присутствует на поверхности моноцитов и макрофагов лошадей in vitro и представляет собой белок, который принадлежит семейству рецепторов фактора некроза опухоли. Выделив и клонировав ген рецептора вируса ИНАН, был проведен ряд работ по генетической трансформации мышиных эмбриональных фибробластов линии NIH 3Т3 экзогенной ДНК, которая содержала нуклеотидные последовательности (н. п.) гена рецептора ELR1 под контролем сильного вирусного промотора ЦМВ (CMV) in vitro. Генетически трансформированные мышиные фибробласты с фенотипом [ELR1neo]+ были чувствительны к вирусу ИНАН в культуре. Оказалось, что наличие рецептора достаточно для втoржения вируса в мышиные фибробласты, однако для его репликации необходим ген циклин Т1 лошади (eCT1) [6, 7]. Продукт этого гена – клеточный белок, который ответственен за связывание с белком Tat лентивируса. Поэтому в следующей серии экспериментов по генетической трансформации мышиных фибробластов были получены клетки с фенотипом [ELR1eCT1neo]+. Такие клетки полностью поддерживали репликацию и продукцию вируса. Основываясь на результатах этой работы, были созданы трансгенные мыши с фенотипом [ELR1eCT1neo]+ [8]. Представляет большой интерес создание эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши, содержащих в геноме н.п. гена рецептора ELR1 вируса ИНАН и eCT1 лошади. Учитывая уникальные свойства ЭСК, которые мы подробно описали в своей работе [4], генетическая трансформация этих клеток позволит создать лабораторную модель для изучения патогенеза вируса ИНАН и иммунного ответа. Мышиные эмбриональные фибробласты линии STO широко используют в качестве фидерного слоя для культивирования многих линий ЭСК [4]. В связи с этим получение генетически трансформированных клеток STO было необходимо как для получения данных о роли рецептора вируса инфекционной анемии лошадей в проникновении вируса в клетку-мишень in vitro, так и для создания генетически-трансформированных ЭСК с фенотипом [ELR1 eCT1]+.

всего просмотров: 1326

Оценка читателей: голосов 0

1. Dimitrov D. S. Cell Biology of Virus Entry // Cell. - 2000. - V.101. - P. 697-702.

2. Montelaro, R.C., Ball J.M., Rushlow K. Equine retroviruses // The Retroviridae. Edited by Levy J.A. - New York: Plenum Press. 1993. – P. 257-360. doi: 10.1007/978-1-4899-1627-3.

3. Leroux C., Cadore J.-L., Montelaro R.C. Equine infectious anemia virus (EIAV): what has HIV’s country cousin got to tell us? // Vet. Res. - 2004.- № 35. – P.485-512.

4. Савченкова И.П., Алексеенкова С.В., Юров К.П. Эмбриональные стволовые клетки мыши – перспективный материал для изучения вируса инфекционной анемии лошадей invitro и invivo // Вопросы вирусологии. - 2016. - Т. 61.- № 3. - С. 107-111.

5. Zhang B., Jin S., Jin J. Li F., Montelaro R.C. A tumor necrosis factor receptor family protein serves as a cellular receptor for the macrophage-tropic equine lentivirus // PNAS. - 2005. – V. 102. - № 28. – P. 9918-9923.

6. Zhang B., Sun C., Jin Ah., Cascio M., Montelaro R.C. Mapping of equine lentivirus receptor residues critical for equine infectious anemia virus envelope binding // J. of Virology. - 2008. – V. 82. - № 3.- P. 1204-1213.

7. Zhang B., Montelaro R.C. Replication of equine infectious anemia virus in engineered mouse NIH 3T3 cells // J Virol. - 2009.- V. 83.- № 4. – P. 2034-37.

8. Du C., Ma J., Liu Q., Li X.-J., Wang X-F., Meng Q-W., Wang X., Zhou J-H. Mice transgenic for equine cyclin T1 and ELR1 are susceptible to equine infectious anemia virus infection // Retrovirology. - 2015.- V. 12. P. 36. doi 10.1186/s12977-015-0163-7.

9. Qian L., Han X., Liu X. Structural insight into equine lentivirus receptor // Protein Science. - 2015. - V. 24. – P. 633-642.

Табл. 1. Олигонуклеотиды для ПЦР и ОТ-ПЦР, названия даны соответственно для ДНК и РНК (Таблица_1.jpg, 64 Kb) [Скачать]

Табл. 2. Эффективность генетической трансформации клеток линии STO плазмидами pcDNA3.1-ELR1 и pcDNA3.1-cycT1 (Таблица_.jpg, 44 Kb) [Скачать]

Анализ экспрессии генов лошади ELR1 и eCT1 в реакции ОТ-ПЦР в генетически-трансформированных клетках мыши линии STO, резистентных к генетицину по сравнению с контролем (дорожка 1) на 7-е сутки (дорожк (Рисунок_1_.jpg, 17 Kb) [Скачать]

Система Orphus

Загрузка...
Вверх