All
 
|
 
 


Сloning and Functional Analysis of SaCLCc1, a Gene Belonging to Chloride Channel Family (CLC) from the Halophyte Suaeda altissima (L.) Pall
 
PIIS086956520000877-7-1
DOI10.31857/S086956520000062-1
Publication type Article
Status Published
Authors
Olga Nedelyaeva 
Affiliation: Timiryazev Institute of Plant Physiology Russian Academy of Sciences
Igor Karpichev
Affiliation: Timiryazev Institute of Plant Physiology Russian Academy of Sciences
Yurii Balnokin
Affiliation:
Timiryazev Institute of Plant Physiology Russian Academy of Sciences
Lomonosov Moscow State University
Larissa Popova
Affiliation: Timiryazev Institute of Plant Physiology Russian Academy of Sciences
Andrey Yurchenko
Affiliation: Theodosius Dobzhansky Center for Genome Bioinformatics
Olga Mayorova
Affiliation: Timiryazev Institute of Plant Physiology Russian Academy of Sciences
Alexey Shuvalov
Affiliation: Timiryazev Institute of Plant Physiology Russian Academy of Sciences
Journal nameDoklady Akademii nauk
EditionVolume 481 Issue 1
Pages104-107
Abstract

   

Keywords
Received12.09.2018
Publication date13.09.2018
Number of characters10530
Cite  
100 rub.
When subscribing to an article or issue, the user can download PDF, evaluate the publication or contact the author. Need to register.
Размещенный ниже текст является ознакомительной версией и может не соответствовать печатной
1 Поддержание низких концентраций ионов Na+ и Cl– в цитозоле при высоких концентрациях NaCl в среде является одним из механизмов, лежащих в основе солеустойчивости растений. Чтобы избежать токсического действия ионов Na+ и Cl–, клетки экспортируют их из цитозоля во внеклеточную среду или в вакуоль. Транспорту Cl– в растениях в условиях почвенного засоления посвящено значительно меньше работ, чем транспорту Na+. Экспортёрами Cl– из цитозоля растительных клеток являются Cl–/H+-антипортеры, которые относятся к семейству CLC (Chloride channel), включающему анион/протонные антипортеры и Cl–-каналы [1]. Эти белки локализованы преимущественно в эндомембранах. Они участвуют в закислении люмена и регуляции трансмембранного электрического потенциала клеточных органелл, накоплении в них анионов, в том числе Cl–, а опосредованно также и Na+. Семь представителей семейства CLC обнаружено у модельного растения Arabidopsis thaliana. AtCLCa–AtCLCc и AtCLCg локализованы в тонопласте, AtCLCd и AtCLCf – в поствезикулах аппарата Гольджи, AtCLCe – в тилакоидах хлоропластов. Показано, что AtCLCa и AtCLCb участвуют в накоплении NO3– в вакуоли [1], а AtCLCc – в накоплении Cl– [2].
2 Поскольку белки CLC вовлечены в компартментализацию Cl– и Na+ и в регуляцию трансмембранного потенциала клеточных органелл, мы предположили, что они играют важную роль в солеустойчивости галофитов. Галофит Suaeda altissima (сведа высокая) является одним из наиболее солеустойчивых растений, способным произрастать на средах, в которых концентрация NaCl достигает 1 M. Ранее было показано [3], что в мембранах комплекса Гольджи, выделенных из клеток корней S. altissima, функционирует Cl–/H+-антипортер.
3 Цель настоящей работы клонировать ген CLC – SaCLCc1 – из S. altissima и определить функциональную роль продукта этого гена путём гетерологичной экспрессии в нокаут-мутанте ∆gef1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ген GEF1 является единственным в семействе CLC у S. cerevisiae. Транспортёр Gef1p локализован в везикулах пост-Гольджи, тонопласте, плазмалемме и участвует в транспорте Cl– [4]. Делеция гена GEF1 приводит к подавлению роста мутантных клеток на железодефицитных средах с неферментируемыми источниками углерода, на минимальных синтетических средах с высокими рН (7,0 и более), на средах с повышенным содержанием токсичных катионов, в частности, Mn2+ и (CH3)4N+ [5].
4 Растения S. altissima выращивали в водной культуре на питательной среде [6] с добавлением 250 мМ NaCl. Суммарную РНК выделяли из корней S. altissima фенольным методом. Первую цепь кДНК синтезировали с помощью ревертазы MINT с праймером 15-dT (“Евроген”, Россия) по протоколу производителя.
5 Дизайн генспецифических праймеров для амплификации кДНК, кодирующей Cl–/H+-антипортер из S. altissima, осуществляли следующим образом. Мы провели in silico поиск последовательностей, относящихся к семейству CLC, в собранном нами de novo транскриптоме близкородственного вида S. fruticosa (L.) Forssk. Массивы коротких прочтений РНК для сборки транскриптома мы взяли из информационной базы SRA (Sequence Read Archive) NCBI (по ссылке PRJNA279962, база BioProject [7]). Качество извлечённых из библиотек SRA коротких прочтений РНК проверили с помощью программы FastQC [8]. Нуклеотиды низкого качества (менее 18), остатки адаптеров Illumina и неопределённые нуклеотиды удалили с помощью программы Trimmomatic [9]. Очищенные риды собрали в контиги с помощью программы Trinity [10]. Аннотацию контигов проводили на основе сходства с последовательностями из базы данных SwissProt [11]. Для этого открытые рамки считывания извлекали из собранных контигов с помощью программы TransDecoder, транслировали в аминокислотные последовательности и сопоставляли алгоритмом программы Diamond blastp [12] с базой данных.

Number of purchasers: 0, views: 1538

Readers community rating: votes 0 

1. Barbier-Brygoo H., De Angeli A., Filleur S., Frachisse J.-M., Cambale F., Thomine S., Wege S. //  Ann. Rev. Plant Biol. 2011. V. 62. P. 25-51.
2. Jossier M., Kroniewicz L., Dalmas F., Le Thiec D., Ephritikhine G., Thomine S., Barbier-Brygoo H., Vavasseur A., Filleur S., Leonhardt N. // Plant J. 2010. V. 64. № 4. P.563-576.
3. Shuvalov A.V., Orlova J.V., Khalilova L.A., Myasoedov N.A., Andreev I.M., Belyaev D.V., Balnokin Y.V. // Russion Journal of Plant Physiology. 2015. V. 62. № 1. P. 45-46.
4. Lopez-Rodriguez A., Trejo A.C., Coyne L., Halliwell R.F., Miledi R., Martinez-Torres A. // 2007. FEMS Yeast Res. V. 7. P. 1218-1229.
5. Gaxiola R.A., Yuan D.S., Klausner R.D., Fink G.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95. P. 4046-4050.
6. Robinson S. P., Downton W. J. S. // Funct. Plant Biol. 1985. V. 12. № 5. P. 471-479.
7. Diray-Arce J., Clement M., Gul B., Khan M.A., Nielsen B.L. // BMC Genomics. 2015. V. 16. №353.
8. Andrews S. // http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/.  2010.
9. Bolger A. M., Lohse M., Usadel B. //  Bioinformatics. 2014. btu170.
10. Haas B. J., Papanicolaou A., Yassour M., Grabherr M., Blood P.D., et al. //Nature protocols. 2013. V. 8. P.1494 – 1512.
11. Bairoch A., Boeckmann B., Ferro S., Gasteiger E. // Brief Bioinform. 2004. V. 5. P. 39 – 55.
12. Buchfink B., Xie C., Huson D.H. // Nat. Methods. 2015. V. 12. P. 59 – 60.
13. Gibson D. G., Young L., Chuang R.-Y., Venter J.C., Hutchison C.A. III, Smith H.O. //Nature Methods. 2009. V. 6. P. 343 – 345.
14. Ehl'darov M.A., Baranov M.V., Dumina M.V., Zhgun A.A., Andreeva N.A., Trilisenko L.V., Kulakovskaya T.V., Ryazanova L.P., Kulaev I.S. // Biokhimiya. 2013. T. 78. № 8. S. 1201-1209.
15. Zifarelli G., Pusch M. // FEBS Lett. 2010. V. 584. P. 2122-2127.

Система Orphus

Loading...
Up