Клонирование и функциональный анализ гена SaCLCc1, принадлежащего семейству хлоридных каналов (CLC), из галофита Suaeda altissima (L.) Pall

Клонировали один из генов семейства CLC (ChlorideChannel) – SaCLCc1 - из галофита Suaedaaltissima(L.) Pall. Для исследования функции SaCLCc1 был экспрессирован в делеционном мутанте S. cerevisiae ∆gef1::LEU2 по единственному в этом организме гену семейства CLC. Рост трансформированного мутанта Δgef1, экспрессирующего SaCLCc1, восстанавливался при выращивании клеток на дефицитной по Fe²⁺ среде YPEG, на минимальных синтетических средах SD и SR (pH 7.0) и на богатой среде YPD, содержащей Mn²⁺. Комплементация фенотипа мутанта Δgef1 геном SaClCc1 свидетельствует об участии белка SaClCc1 в транспорте ионов Cl^-.

Ключевые слова

Источник финансирования

Работа выполнена при частичной поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 16–34–00991мол_а.

Получено

12.09.2018

Дата публикации

13.09.2018

Кол-во символов

10530

Цитировать

ГОСТ	Неделяева О. И. , Карпычев И. В. , Балнокин Ю. В. , Попова Л. Г. , Юрченко А. А. , Майорова О. В. , Шувалов А. В. Клонирование и функциональный анализ гена SaCLCc1, принадлежащего семейству хлоридных каналов (CLC), из галофита Suaeda altissima (L.) Pall // Доклады Академии наук – 2018. – Tом 481. – Номер 1 C. 104-107 [Электронный ресурс]. URL: http://ras.jes.su/dan/s207987840000298-6-1 (дата обращения: 05.05.2024). DOI: 10.31857/S086956520000062-1
MLA	Nedelyaeva, Olga, Karpichev, Igor, Balnokin, Yurii, Popova, Larissa, Yurchenko, Andrey, Mayorova, Olga, Shuvalov, Alexey "Сloning and Functional Analysis of SaCLCc1, a Gene Belonging to Chloride Channel Family (CLC) from the Halophyte Suaeda altissima (L.) Pall." Doklady Akademii nauk 481.1 (2018):104-107. DOI: 10.31857/S086956520000062-1
APA	Nedelyaeva O., Karpichev I., Balnokin Y., Popova L., Yurchenko A., Mayorova O., Shuvalov A. (2018). Сloning and Functional Analysis of SaCLCc1, a Gene Belonging to Chloride Channel Family (CLC) from the Halophyte Suaeda altissima (L.) Pall. Doklady Akademii nauk 481(1), pp.104-107 DOI: 10.31857/S086956520000062-1

100 руб.

При оформлении подписки на статью или выпуск пользователь получает возможность скачать PDF, оценить публикацию и связаться с автором. Для оформления подписки требуется авторизация.

Оператором распространения коммерческих препринтов является ООО «Интеграция: ОН»

Размещенный ниже текст является ознакомительной версией и может не соответствовать печатной.


1	Поддержание низких концентраций ионов Na⁺ и Cl^–в цитозоле при высокихконцентрациях NaCl в среде является одним из механизмов, лежащих в основе солеустойчивости растений. Чтобы избежать токсического действия ионов Na⁺ и Cl^–, клетки экспортируют их из цитозоля во внеклеточную среду или в вакуоль. Транспорту Cl^– в растениях в условиях почвенного засоления посвящено значительно меньше работ, чем транспорту Na⁺. Экспортёрами Cl^– из цитозоля растительных клеток являются Cl^–/H⁺-антипортеры, которые относятся к семейству CLC (Chloride channel), включающему анион/протонные антипортеры и Cl^–-каналы [1]. Эти белки локализованы преимущественно в эндомембранах. Они участвуют в закислении люмена и регуляции трансмембранного электрического потенциала клеточных органелл, накоплении в них анионов, в том числе Cl^–,а опосредованно также и Na⁺. Семь представителей семейства CLC обнаружено у модельного растения Arabidopsis thaliana. AtCLCa–AtCLCc и AtCLCg локализованы в тонопласте, AtCLCd и AtCLCf – в поствезикулах аппарата Гольджи, AtCLCe – в тилакоидах хлоропластов. Показано, что AtCLCa и AtCLCb участвуют в накоплении NO₃^– в вакуоли [1], а AtCLCc – в накоплении Cl^– [2].
2	Поскольку белки CLC вовлечены в компартментализацию Cl^– и Na⁺ и в регуляцию трансмембранного потенциала клеточных органелл, мы предположили, что они играют важную роль в солеустойчивости галофитов. Галофит Suaeda altissima (сведа высокая) является одним из наиболее солеустойчивых растений, способным произрастать на средах, в которых концентрация NaCl достигает 1 M. Ранее было показано [3], что в мембранах комплекса Гольджи, выделенных из клеток корней S. altissima, функционирует Cl^–/H⁺-антипортер.
3	Цель настоящей работы клонировать ген CLC – SaCLCc1 – из S. altissima и определить функциональную роль продукта этого гена путём гетерологичной экспрессии в нокаут-мутанте ∆gef1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ген GEF1 является единственным в семействе CLC у S. cerevisiae. Транспортёр Gef1p локализован в везикулах пост-Гольджи, тонопласте, плазмалемме и участвует в транспорте Cl^– [4]. Делеция гена GEF1 приводит к подавлению роста мутантных клеток на железодефицитных средах с неферментируемыми источниками углерода, на минимальных синтетических средах с высокими рН (7,0 и более), на средах с повышенным содержанием токсичных катионов, в частности, Mn²⁺ и (CH₃)₄N⁺ [5].
4	Растения S. altissima выращивали в водной культуре на питательной среде [6] с добавлением 250 мМ NaCl. Суммарную РНК выделяли из корней S. altissima фенольным методом. Первую цепь кДНК синтезировали с помощью ревертазы MINT с праймером 15-dT (“Евроген”, Россия) по протоколу производителя.
5	Дизайн генспецифических праймеров для амплификации кДНК, кодирующей Cl^–/H⁺-антипортер из S. altissima, осуществляли следующим образом. Мы провели in silico поиск последовательностей, относящихся к семейству CLC, в собранном нами de novo транскриптоме близкородственного вида S. fruticosa (L.) Forssk. Массивы коротких прочтений РНК для сборки транскриптома мы взяли из информационной базы SRA (Sequence Read Archive) NCBI (по ссылке PRJNA279962, база BioProject [7]). Качество извлечённых из библиотек SRA коротких прочтений РНК проверили с помощью программы FastQC [8]. Нуклеотиды низкого качества (менее 18), остатки адаптеров Illumina и неопределённые нуклеотиды удалили с помощью программы Trimmomatic [9]. Очищенные риды собрали в контиги с помощью программы Trinity [10]. Аннотацию контигов проводили на основе сходства с последовательностями из базы данных SwissProt [11]. Для этого открытые рамки считывания извлекали из собранных контигов с помощью программы TransDecoder, транслировали в аминокислотные последовательности и сопоставляли алгоритмом программы Diamond blastp [12] с базой данных.

Всего подписок: 0, всего просмотров: 1542

Оценка читателей: голосов 0

1. Barbier-Brygoo H., De Angeli A., Filleur S., Frachisse J.-M., Cambale F., Thomine S., Wege S. // Ann. Rev. Plant Biol. 2011. V. 62. P. 25-51.

2. Jossier M., Kroniewicz L., Dalmas F., Le Thiec D., Ephritikhine G., Thomine S., Barbier-Brygoo H., Vavasseur A., Filleur S., Leonhardt N. // Plant J. 2010. V. 64. № 4. P.563-576.

3. Shuvalov A.V., Orlova J.V., Khalilova L.A., Myasoedov N.A., Andreev I.M., Belyaev D.V., Balnokin Y.V. // Russion Journal of Plant Physiology. 2015. V. 62. № 1. P. 45-46.

4. Lopez-Rodriguez A., Trejo A.C., Coyne L., Halliwell R.F., Miledi R., Martinez-Torres A. // 2007. FEMS Yeast Res. V. 7. P. 1218-1229.

5. Gaxiola R.A., Yuan D.S., Klausner R.D., Fink G.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95. P. 4046-4050.

6. Robinson S. P., Downton W. J. S. // Funct. Plant Biol. 1985. V. 12. № 5. P. 471-479.

7. Diray-Arce J., Clement M., Gul B., Khan M.A., Nielsen B.L. // BMC Genomics. 2015. V. 16. №353.

8. Andrews S. // http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/. 2010.

9. Bolger A. M., Lohse M., Usadel B. // Bioinformatics. 2014. btu170.

10. Haas B. J., Papanicolaou A., Yassour M., Grabherr M., Blood P.D., et al. //Nature protocols. 2013. V. 8. P.1494 – 1512.

11. Bairoch A., Boeckmann B., Ferro S., Gasteiger E. // Brief Bioinform. 2004. V. 5. P. 39 – 55.

12. Buchfink B., Xie C., Huson D.H. // Nat. Methods. 2015. V. 12. P. 59 – 60.

13. Gibson D. G., Young L., Chuang R.-Y., Venter J.C., Hutchison C.A. III, Smith H.O. //Nature Methods. 2009. V. 6. P. 343 – 345.

14. Эльдаров М.А., Баранов М.В., Думина М.В., Жгун А.А., Андреева Н.А., Трилисенко Л.В., Кулаковская Т.В., Рязанова Л.П., Кулаев И.С. // Биохимия. 2013. Т. 78. № 8. С. 1201-1209.

15. Zifarelli G., Pusch M. // FEBS Lett. 2010. V. 584. P. 2122-2127.